|
Publicações
A seguir são apresentados, de forma resumida, alguns trabalhos técnico-científicos
publicados pela equipe da GENOMAX em congressos e simpósios no Brasil.
Estes trabalhos visam ilustrar o compromisso constante da GENOMAX com a
pesquisa, o desenvolvimento e a inovação nas aplicações da análise de
DNA na genética e melhoramento de animais e plantas cultivadas.
1. Marcadores de DNA para registro de
animais e diagnóstico de maciez de carne
2. Diversidade alélica e
desempenho forense de um conjunto multiplex de 11 marcadores microssatélites
em populações bovinas de Nelore e Gir (Bos indicus)
3. Análise de pureza genética
de linhagens de milho com marcadores microssatélites em sistemas
multiplex
4. Discriminação de
cultivares e linhagens experimentais de soja com base em painéis de
multiplexes de marcadores microssatélites
5. Desenvolvimento e análise
genética de um banco de dados de perfis genéticos de marcadores
microssatélites das variedades de soja protegidas no Brasil
6. Aplicações
operacionais da análise de vínculo genético com microssatélites em
populações de melhoramento de Eucalyptus
7. Variação genética e
endocruzamento em populações brasileiras de quatro raças caninas com
base na análise de marcadores microssatélites
1.
Marcadores de DNA para registro de animais e diagnóstico de maciez de
carne Topo
Palestra convidada ministrada pelo Prof. Dr. Dario Grattapaglia no IV Simpósio
Nacional das Raças Simental e Simbrasil em 15 de Junho de 2004
Para
um arquivo pdf da palestra apresentada clique aqui
Nesta palestra O Dr. Dario Grattapaglia apresentou uma discussão dos vários
aspectos técnicos e legais relacionados com a identificação animal
baseada no DNA. Os tópicos incluíram: (1) Tipagem no serviço de
registro genealógico; (2) Tipagem sanguínea x DNA: vantagens e desafios;
(3) Base genética e validação ISAG de marcadores moleculares; (4)
Aplicações do DNA no gerenciamento genético de rebanhos. Em seguida foi
apresentada uma revisão do status atual dos testes de DNA para maciez de
carne. Para isso foi inicialmente explicado de forma sucinta o princípio
do mapeamento de QTL e mapeamento por associação e a base genética e
molecular dos principais testes comercias existentes. Para finalizar foram
discutidas de forma crítica e realista as questões que ainda existem em
relação à validação destes testes em diferentes raças bovinas e as
considerações que o criador deve fazer ao decidir adotar estes testes de
DNA no seu rebanho.
2. Diversidade alélica e
desempenho forense de um conjunto multiplex de 11 marcadores microssatélites
em populações bovinas de Nelore e Gir (Bos indicus)
Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 50º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Florianópolis em 2004
Para
visualização do resumo do pôster apresentado clique aqui
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
INTRODUÇÃO
O gênero Bos compreende duas espécies domesticadas de gado: B. indicus e
B. taurus. O Brasil possui o maior rebanho bovino do mundo, totalizando,
aproximadamente, 170 milhões de cabeças (IBGE, 2000). A criação de
bovinos no Brasil é responsável, direta ou indiretamente, por
aproximadamente de 20% do PIB brasileiro, totalizando 160 bilhões de dólares
por ano na cadeia produtiva (IBGE, 2001).
A criação de bovinos destina-se a dois mercados principais: a produção
de carne e a produção de leite e derivados. O gado zebuíno é
utilizado, principalmente, para produção de carne. O Brasil conquistou,
em 2003, a posição de maior exportador mundial de carne bovina. Cerca de
92% do rebanho é constituído por raças de B. indicus, também
conhecidas como gado zebu ou zebuíno. O restante é constituído por
animais da espécie B. taurus, também conhecidos como gado taurino. As
principais raças zebuínas que compõem o rebanho brasileiro são a
Nelore, a Girl, a Guzerá, entre outras, contribuindo com cerca de 90%
deste rebanho (IBGE, 2001). O objeto deste trabalho são duas raças de
Bos indicus de grande importância econômica para o país: Nelore e Gir
(Figuras 1 e 2).
Entre os problemas comumente enfrentados pelos criadores destaca-se a
necessidade de estimar o nível de endogamia dos rebanhos visando a redução
de cruzamentos aparentados, bem como o controle de enfermidades oriundas
da exposição de alelos deletérios (ex., diminuição de fertilidade,
displasias, etc.). Este conhecimento potencialmente refletirá na redução
de ocorrência de doenças genéticas pela vulnerabilidade de rebanhos
homogêneos, resultantes de cruzamentos endogâmicos. Há necessidade,
portanto, de utilização de ferramentas eficazes para orientar os
cruzamentos de modo manter ou maximizar a sua diversidade genética. Outra
atividade que trará conseqüências positivas para a organização da
pecuária com reflexos na qualidade do rebanho é o controle de qualidade
de amostras de sêmen utilizadas em inseminação artificial, com comprovação
de origem genética das amostras a serem inseminadas. O primeiro impacto
é o controle efetivo dos produtos resultantes de inseminação artificial
e de transplante de embrião. Da mesma forma, a identificação genética
individual para fins de registro genealógico em Associações de
Criadores é fundamental, minimizando os danos de erros involuntários ou
falsificação de registro, atestando e comprovando os pedigrees
declarados e reduzindo o potencial de fraude (paternidade, maternidade,
etc.).
Algumas estimativas sugerem que uma freqüência de erro de identificação
de 15% pode ocasionar um decréscimo de 8,7% a 16,9% no ganho genético
anual em bovinos (Geldermann et al. 1986 J. Anim. Sci., 63:1759-68, 1986).
Deve ser ressaltado que a própria estimativa de parâmetros genéticos
populacionais, do mérito genético dos indivíduos e do ganho genético
em programas de melhoramento depende da sua correta genealogia.
Estimativas de erros de identificação de bovinos no rebanho brasileiro
infelizmente ainda não são disponíveis ou divulgadas.
Tem sido comum a discussão sobre classificação racial, centrada na
definição de critérios mínimos para concessão de registro de um
animal em determinada raça, de acordo com descritores validados e
padronizados. O desenvolvimento de sistemas adequados de classificação
de animais baseados em critérios genéticos, herdáveis, ao contrário do
emprego de características estéticas de baixa herdabilidade e grande
controvérsia, tem por certo um grande papel na atividade pecuária. Neste
sentido, a análise de DNA, por se constituir em material eminentemente
genético, oferece um conjunto de ferramentas que servem adequadamente a
todos estes propósitos.
OBJETIVOS
1. Otimização e implementação em rotina de dois sistemas multiplex de
PCR e uma pista única em sequenciador com detecção fluorescente para a
análise de polimorfismos de 11 locos microsatélites (STR) autossômicos
e um loco de determinação de sexo em bovinos;
2. Construção de bancos de dados de freqüências alélicas para os
locos STR com finalidades forense e de investigação de vínculo genético
em populações de duas raças de Bos indicus, Nelore e Gir.;
3. Avaliação dos parâmetros de desempenho forense para investigação
de paternidade e identificação individual de cada loco individualmente,
e do sistema multiplex completo
4. Utilização da bateria de marcadores microssatélites para estimar
alguns parâmetros genéticos populacionais para as raças bovinas Nelore
e Gir, como o grau de diferenciação genética entre as raças por efeito
de deriva genética (Fst) e o coeficiente de endocruzamento devido a
cruzamentos entre indivíduos aparentados (Fis).
PRINCIPAIS CONLCUSÕES (visualize figuras e tabelas no arquivo pdf
do pôster)
Os dois sistemas multiplex desenvolvidos permitem uma tipagem extremamente
rápida e eficiente de onze locos STR + Amelogenina em duas reações de
PCR, e resolução em uma pista de eletroforese (Figura 3). Embora a
co-amplificação de todos os onze locos em uma única reação de PCR
seja possível, foi observado um comprometimento da qualidade da amplificação
com o aparecimento de produtos inespecíficos que dificultam a análise.
Estimativas de freqüências alélicas para os onze locos STR (Figura 5)
foram utilizadas para gerar as estimativas de desempenho forense para os
locos individualmente (Tabela 1) bem como para o conjunto multiplex
(Tabela 2). O número total de alelos variou de um mínimo de 5 para os
locos ETH10 (Nelore e Gir), ETH03 (Nelore) e SPS115 (Gir), até um máximo
de 17 para o loco TGLA122 (Nelore).
Em todos os locos foram observados alelos com freqüência acima de 20%,
indicando que a distribuição de freqüências alélicas não é uniforme
entre locos e entre raças (Figura 5). Caso extremo para o loco TGLA227
onde o alelo 77 tem frequência acima de 80% em ambas as raças, ou seja,
praticamente fixado. Foram detectados casos extremos em que um determinado
alelo tem alta freqüência em uma população, enquanto os outros alelos
do mesmo loco apresentam baixa freqüência. Por exemplo, no loco
microssatélite TGLA122 o alelo 135 tem alta freqüência na população
de Gir (0,54) enquanto na população de Nelore a freqüência de todos os
alelos é homogeneamente baixa (< 0,2). Em outro loco, o SPS115, o
alelo 248 tem alta freqüência em ambas as populações estudadas (acima
de 0,61 em Gir e 0,39 em Nelore). Da mesma forma, o alelo 158 do loco
ETH225 tem freqüência alta nas duas populações, 0,52 em Nelore e 0,54
em Gir (Figura 5).
A bateria de 11 locos possui em média 11,36 alelos por loco, o que
caracteriza uma diversidade alélica expressiva. Na raça Nelore o número
de alelos por loco variou de cinco (ETH10) a 17 (TGLA122) alelos
observados, com média de 9,0 alelos/loco. Já na raça Gir, o número de
alelos variou de cinco (ETH10) a 14 (TGLA122), com média de 8,91
alelos/loco. O tamanho dos alelos oscilou dentro do esperado para locos
microssatélites, variando de 59 a 258 pb (Figura 5). Estas médias não
apresentam disparidade com análises similares feitas com estes mesmos
microssatélites em bovinos de outras raças (Heyen et al., 1997 Animal
Genetics 1997, 28:21-27; Peelman et al., 1998 Animal Genetics 1998,
29:161-167).
A heterozigosidade média esperada para a bateria de 11 locos nas duas raças
foi de 0,678, indicando um grande potencial de uso desta bateria na avaliação
de individualidade e determinação de parentesco. A heterozigosidade média
observada (Ho) foi nominalmente menor que a esperada (He) tanto na raça
Nelore quanto em Gir (Tabela 3). O coeficiente de endocruzamento (Fis) médio
dos 11 locos para a raça Nelore foi de 0,102, e para a Gir foi 0,046.
Para cada raça o intervalo de confiança sobre a estimativa de Fis foi de
0,042 a 0,173 para Nelore e -0,040 a 0,145 em Gir, indicando que existe
endocruzamento significativo em Nelore, mas não em Gir. Foi estimado uma
diferenciação genética significativa entre as duas raças com um Fst=
0,077 (I.C. 95% 0,055 a 0,106).
A alta heterozigosidade esperada na maioria dos locos analisados indica
que os locos utilizados possuem um alto poder de discriminação
individual para cada raça, sugerindo um alto potencial para utilização
do conjunto multiplex em testes de identidade genética e
paternidade/maternidade. As estimativas de probabilidade de identidade
baseadas na utilização do multiplex de 11 locos para a raça Nelore é
menor do que 1,55 x 10-9. Para a raça Gir, a probabilidade de Identidade
é menor do que 4,039 x 10-9. A probabilidade de dois animais zebuínos da
mesma raça apresentarem o mesmo perfil multiloco nesta bateria de STR é
menor do que 1 em 640 milhões em Nelore e 1 em 250 milhões em Gir
(Tabela 2).
A estimativa de Probabilidade de Exclusão de paternidade para cada loco
individualmente variou de 0,07 a 0,47 para a raça Nelore, com valor
combinado da bateria de locos estimado em 99,126%. A estimativa de
Probabilidade de Exclusão de paternidade para a raça Gir variou de 0,02
a 0,63, com valor combinado da bateria de locos estimado em 99,254%. Ou
seja, a probabilidade de um genitor(a) ser excluído(a) da possibilidade
de ser o pai ou mãe biológico(a) de um produto com a bateria de locos
analisados é próxima de 100%, o que indica o alto potencial para utilização
do conjunto multiplex em testes de paternidade ou maternidade com eficiência
significativamente maior do que tipagem sanguínea.
O Banco de Dados de Freqüências Alélicas construído para as raças
Nelore e Gir é uma importante contribuição para a análise genética do
rebanho bovino nacional. Os dados permitem de imediato a unificação da
metodologia de tipagem de animais baseada em DNA entre os laboratórios
brasileiros e a comunidade científica internacional, além de permitir a
comparação de dados com um banco de dados envolvendo duas espécies de
Bos taurus, Holandesa e Simental (Barbosa, 2003, CNG 2003) bem como
relatos na literatura internacional.
Impactos significativos são esperados nas rotinas de testes de
paternidade/maternidade para fins de registro, em disputas forenses que
exijam testes de identidade genética e/ou análise de vínculo, em
controle de qualidade de amostras de sêmen, em estimativas de diversidade
genética de rebanhos, na reconstituição de pedigrees e definição de
cruzamentos, na rastreabilidade de amostras biológicas comerciais, entre
outros. Além do impacto no setor produtivo, o emprego desta tecnologia
permite incremento de eficiência dos programas de melhoramento genético
na busca de maior produtividade e qualidade do rebanho.
ABSTRACT (Resumo em Inglês)
DNA typing with microsatellite markers is rapidly substituting blood
typing and has become the international standard for individual
identification and determination of paternity and maternity relationships
in bovine populations. Brazil, however, only now is starting to adopt this
technology. A number of advantages derive from the use of DNA markers
including (1) the much higher power of discrimination and exclusion and in
paternity testing especially when testing does not involve the cow; (2)
the possibility of declaring paternity even in situatuons of known common
ancestry; (3) the utility of the DNA data for population and mating
management and (4) the possibility of typing from various tissues other
than blood. We have optimized the amplification and three-color
fluorescent detection of 11 dinucleotide microsatellite markers in two PCR
reactions for bovine high throughput genetic fingerprinting. The multiplex
system includes all nine internationally recommended loci for bovine
typing by the International Society of Animal Genetics: BM1824, BM2113,
ETH10, ETH225, SPS115, TGLA122, TGLA227, TGLA126, INRA23, plus two
additional loci ETH3, TGLA53 and the sex determining locus Amelogenin. We
have typed these loci in proficieny ring trials run annually by the
International Society of Animal Genetics. Based on ISAG confirmed test
samples we constructed virtual allelic ladders using the ABI Genotyper
software to allow precise allelic declaration in conformity to the ISAG
standards. Allele frequency data have been collected from 96 genetically
unrelated animals for each one of the two Bos indicus races, Nelore and
Gir. Private low frequency (<5%) alleles were observed at all loci,
most of them therefore subject to sampling effects. Interestingly however,
a combination of two relatively higher frequency private alleles at loci
SPS115 and INRA23 were observed in Nelore that could allow the estimation
of a likelihood of an animal belonging to this race. No such alleles were
observed in Gir. In Nelore, with the exception of locus INRA23 , at all
other markers the observed heterozigosty was lower than the expected one
indicating a significant level of inbreeding. In Gir on the other hand,
with the exception of loci TGLA227 and TGLA126, at all other loci the
observed heterozigosity was slightly higher than the expected one.
Accordingly, multilocus inbreeding coefficients were significantly
different from zero in Nelore (Fis=0.11) (confidence interval at 95% by
“bootstrap”) and not significantly different from zero in Gir (Fis=
-0.008). In 37 out of 55 tests, significant linkage disequilibrium
(p<0.05) was detected. In Nelore, power of paternity exclusion (PE) for
the loci varied from a lowest 2.3% for locus TGLA227 in Gir (TGLA227 is
essentially fixed for allele 77 in Bos indicus) to a highest 68,4% for
TGLA122 in Nelore. Power of Discrimnation (PD) varied from 0.31 for
TGLA227 to 0.96 for TGLA122. For the large majority of markers loci PE was
between 30 and 50%. The 11 loci combined yielded a PE above 99% in both
races. This multiplex system is routinely used in our laboratory for
efficient bovine typing and parentage confirmation required in elite
animal registration.
3. Análise de pureza genética
de linhagens de milho com marcadores microssatélites em sistemas
multiplex Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 50º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Florianópolis em 2004
Para
visualização do resumo do pôster apresentado clique aqui
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
RESUMO
Baterias de microssatélites altamente polimórficos, localizados em
cromossomos distintos e otimizados em sistemas multiplex de PCR tem sido
utilizados de forma crescente no nosso laboratório para a resolução de
questões de pureza genética de linhagens puras de milho em suporte a
programas avançados de produção de sementes híbridas da cultura.
Este trabalho descreve especificamente dois estudos nos quais o poder de
resolução dos microssatélites permitiu avaliar com precisão o nível
de homozigose bem como mistura de linhas, heterozigose devido a contaminação
em amostras de sementes de linhagens de milho. Num primeiro estudo,
amostras de 20 plântulas por linhagem foram analisadas em preparação a
um programa de conversão de linhagens via retrocruzamento assistido por
marcadores. O objetivo era verificar o grau de pureza de diferentes lotes
de sementes genéticas e de sementes básicas derivadas destas visando
recomendar o melhor lote a ser utilizado no programa. Existiam suspeitas,
com base na avaliação fenotípica a campo, de ter havido seja mistura de
linhagens bem como contaminação entre linhagens durante o processo de
multiplicação de sementes nos últimos anos. Três linhagens tropicais,
GMX1 a GMX10, correspondiam às linhagens tropicais enquanto GMX11 a GMX12
às linhagens temperadas. As amostras GMX1 a GMX3 constituíam amostras de
sementes genéticas enquanto GMX4 sementes básicas da mesma linhagem;
GMX5 a GMX7, sementes genéticas enquanto GMX8 sementes básicas da mesma
linhagem e GMX9, sementes genéticas enquanto GMX10 sementes básicas da
mesma linhagem. Uma amostra em bulk constituída de 10 mg de tecido foliar
de cada uma das 10 plântulas foi extraída e analisada. Adicionalmente
amostras de 4 a 8 plântulas individuais por linhagem foram genotipadas
para discriminar entre as possibilidades de mistura de linhas versus
heterozigose. Nove marcadores microssatélites independentes foram
utilizados sendo que dois marcadores mapeando nas regiões distais do
cromossomo 1 e os demais sete em cromossomos distintos. Marcadores phi015,
phi056, phi093, phi064, phi083, phi032 e phi072 são de repetições de
tetranucleotídeos enquanto phi085 e phi053 são de penta e trinucleotídeos
respectivamente. Estes marcadores são recomendados para proteção
varietal em função do seu elevado poder de discriminação e robustez na
interpretação de genótipos (Matsuoka et al. 2002 TAG 104:436).
Marcadores foram amplificados em duas reações de PCR e analisados
simultaneamente em um seqüenciador ABI377XL. Escadas alélicas virtuais
foram construídas usando o software Genotyper permitindo assim a declaração
precisa de alelos em estudos independentes. As amostras GMX1, GMX2, GMX3,
GMX5, GMX7 apresentaram homozigose em todos os locos testados indicando um
elevado grau de pureza, esperado para sementes genéticas. A amostra GMX6,
entretanto, apresentou mais de um alelo em dois locos sugerindo mistura de
linhas ou heterozigose. As amostras de sementes básicas GMX4, GMX8 e
GMX10 apresentaram vários locos com mais de um alelo. As amostras GMX4 e
GMX8 apresentaram pelo menos uma plântula individual em heterozigose em
seis dos nove locos testados. Amostras GMX9 e GMX10 aprsentram indivíduos
heterozigostos e alelos adicionais nos bulks, não detectados nas plântulas
individuais indicando claramente a ocorrência simultânea de mistura de
linhas e heterozigose possivelmente devido à contaminação. As linhagens
temperadas GMX11 e GMX12 foram homozigotas a todos os locos com exceção
do loco phi085 para GMX12, sugestivo de duplicação de loco.
Em conclusão, pureza genética foi em geral encontrada nas amostras de
sementes genéticas mas não nas amostras de sementes básicas onde
heterozigose possivelmente devido à contaminação bem como mistura de
linhas foram claramente detectadas. Entretanto, o compartilhamento de
alelos entre as amostras de sementes genéticas e básicas da mesma
linhagem, indicam que uma derivou da outra com exceção da comparação
GMX9 e GMX10.
Esta análise permitiu ao melhorista selecionar o lote de sementes mais
puro e adequado para garantir o sucesso do programa de retrocruzamento
assistido por marcadores. Num segundo estudo foram analisadas cinco
amostras de sementes da mesma linhagem pura de milho para verificar a
existência de possíveis misturas. Uma bateria ampliada com 22 microssatélites,
cobrindo os 20 braços cromossômicos do milho foi utilizada. Todas as
cinco amostras se apresentaram totalmente homozigotas e indistinguíveis
eliminando assim a suspeita de ter havido mistura de linhas ou contaminação
durante o processo de manutenção das linhas e multiplicação de lotes
de sementes.
4. Discriminação de
cultivares e linhagens experimentais de soja com base em painéis de
multiplexes de marcadores microssatélites
Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 50º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Florianópolis em 2004
Para
visualização do resumo do pôster apresentado clique aqui
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
RESUMO
O requerimento de proteção varietal em plantas cultivadas é baseado em
descritores clássicos como característicasmorfológicas avaliadas em
diferentes ambientes. A abundância de polimorfismo de descritores
morfológicos é potencialmente restrita em espécies de estreita base genética.
A instabilidade dos descritores morfológicos em diferentes ambientes
restringe o seu número e,por conseguinte, a sua capacidade discriminatória.
A análise de polimorfismo de sequência de DNA, por outro lado,
permite uma elevada precisão na identificação genética e
discriminação revelando extenso polimorfismo e estabilidade
ambiental. É provável que polimorfismo de marcadores moleculares
hipervariáveis como microssatélites sejam cada vez mais utilizados em
testes de DHE (distinguibilidade, homogeneidade e estabilidade) para
fins de proteção varietal, especialmente em espécies de base genética
estreita,como a soja.
Este estudo teve por objetivo avaliar o poder de resolução de marcadores
microssatélites na discriminação individual de centenas de variedades
comerciais e linhagens experimentais de soja plantadas no Brasil.A análise
genética foi realizada em sistema de prova e contraprova em experimentos
“cegos”, onde a relação de vínculo genéticoe/ou comercial entre as
amostras não era conhecida. A determinação do perfil genético
dos cultivares foi realizada em 14 a 20 locos microssatélites
internacionalmente recomendados para soja por apresentarem alto conteúdo
informativo e robustez analítica. Os locos selecionados são constituídos
de repetições em tandem de trinucleotídeos ou dinucleotídeos,
genotipados em sistemas “multiplexes” de análise simultânea em seqüenciador
automático de DNA ABI Prism 377XL.
Os genótipos foram descritos com os alelos em pares de bases.As diferenças
genéticas entre os cultivares/linhagensforam reveladas pelas diferenças
no comprimento das sequências de DNA ampli ficadas em cada
loco.Entre as variedades comerciais analisadas, 125 representam
germoplasma protegido. Destas, 123 foram declaradas geneticamente
distintas e apenas duas foram geneticamente indistinguíveis com os
marcadores utilizados. Utilizou-se, para este fim, o critério mínimo
de duas diferenças genéticas para declarar dois materiais como distintos
com elevada confiabilidade. Algumas variedades comerciais
apresentaram fortes indícios de mistura de linhas e/ou evidência de
heterozigosidade residual, sugerindo a necessidade de um controle mais rígido
no monitoramento do processo de produção de sementes. Várias linhagens
experimentais mostraram-se geneticamente idênticas a linhagens
controle,apesar de ainda apresentarem alguma diferença morfológica como
variação na coloração do hilo.
Foram observados diversos alelos não reportados anteriormente em análises
similares com germoplasma de outros países,o que indicaria a utilização
de material genético exclusivo no pool gênico brasileiro.Este trabalho
estabelece de forma pioneira um sistema de identi ficação genética
de cultivares de soja baseado em uma tecnologia rápida,econômica e,mais
importante,de alto poder de resolução,que poderá se constituir em uma
ferramenta inovadora para testes de DHE no processo de proteção varietal.
Os resultados possibilitam o estabelecimento de um sistema eletrônico de
comparação na condução de testes de identidade genética entre
amostras questionadas e amostras padrão visando o controle de qualidade e
fiscalização da comercialização de sementes.
5. Desenvolvimento e análise
genética de um banco de dados de perfis genéticos de marcadores
microssatélites das variedades de soja protegidas no Brasil
Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 49º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Águas de Lindóia em 2003
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
RESUMO
A análise da variabilidade genética na sequência do DNA pela tecnologia
de marcadores moleculares permite uma elevada precisão na identificação
e discriminação varietal. Perfis genéticos de marcadores moleculares
poderão, em breve, tornar-se importantes descritores complementares no
requerimento de proteção de novo cultivar, particularmente em espécies
autógamas de base genética estreita.
Amostras oficiais de sementes de cada cultivar de soja foram fornecidas
para análise em sacos lacrados e identificados pelo LADIC/SNPC/MAPA. A análise
genética foi realizada em sistema de prova e contraprova em experimentos
“cegos”, onde a relação de vínculo genético e/ou comercial entre
as amostras não era conhecida. Análise de sementes individuais da
variedade foi realizada em casos onde havia indícios de contaminação ou
mistura de sementes. Para a determinação do perfil genético dos
cultivares foi realizada inicialmente uma triagem de 21 locos microssatélites
internacionalmente recomendados para soja, dos quais foram selecionados 15
por apresentarem maior conteúdo informativo e robustez analítica. Os 15
locos selecionados, sendo 12 de trinucleotídeos e 3 dinucleotídeos,
foram genotipados em quatro sistemas “multiplexes” de análise simultânea
de vários locos em um seqüenciador automático de DNA ABI Prism 377XL, e
os genótipos descritos com os alelos em pares de bases.
As diferenças genéticas entre os cultivares foram claramente reveladas
pelas diferenças no comprimento das sequências de DNA amplificadas, ou
seja dos alelos. Das 125 amostras analisadas, 123 foram declaradas
geneticamente distintas e apenas duas foram geneticamente indistinguíveis
com os 15 marcadores utilizados. Outros três pares de amostras
apresentaram apenas uma diferença que requer uma confirmação com análises
de locos adicionais para verificar se as amostras que compõem cada par são
de fato diferentes, ou se a diferença observada é devida a uma rara mutação
genética na sequência de DNA no marcador testado. Neste sentido,
recomenda-se adotar uma abordagem conservadora e exigir no mínimo duas
diferenças genéticas para declarar a distiguibilidade com elevada
confiabilidade. Três amostras apresentaram fortes indícios de mistura de
linhas e uma amostra apresentou evidências de heterozigosidade residual.
Em ambos os casos uma análise complementar com maior número de sementes
individuais deverá ser realizada para confirmar definitivamente estas hipóteses.
Foi observada uma elevada diversidade alélica entre os 125 cultivares,
embora em alguns locos determinados alelos apresentem frequências
elevadas. Em média, os locos utilizados apresentaram 5,9 alelos com uma
variação de três a nove. Apenas três dos quinze locos apresentaram uma
diversidade gênica abaixo de 0,5 enquanto que quatro locos mostraram uma
diversidade acima de 0,7. Tanto a faixa de tamanho de alelos bem como o
poder de discriminação observado para estes 15 locos no germoplasma
brasileiro estão de acordo com o que tem sido descrito para o germoplasma
norte-americano.
É interessante observar, entretanto, que no conjunto de 125 cultivares,
foram observados diversos alelos não reportados anteriormente o que
confirma o fato de material genético exclusivo do Brasil estar presente
no pool gênico protegido. Em conclusão, este trabalho estabelece de
forma pioneira um sistema de identificação genética de cultivares de
soja baseado em uma tecnologia rápida, econômica e, mais importante, de
alto poder de resolução, que poderá se constituir em uma ferramenta
inovadora para testes de DHE no processo de proteção varietal.
O banco de dados de perfis genéticos dos cultivares de soja construído
poderá ser imediatamente utilizado para o estabelecimento de um sistema
eletrônico de comparação na condução de testes de identidade genética
entre amostras questionadas e amostras padrão no controle de qualidade e
fiscalização na cadeia de comercialização de sementes.
6. Aplicações operacionais da
análise de vínculo genético com microssatélites em populações de
melhoramento de Eucalyptus Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 49º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Águas de Lindóia em 2003
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
RESUMO
Baterias de microssatélites altamente polimórficos, localizados em
cromossomos distintos e otimizados em sistemas multiplex de PCR estão
sendo utilizados de forma crescente no nosso laboratório para a resolução
de questões de identidade e vínculo genético em suporte a programas
industriais de melhoramento florestal.
Este trabalho descreve especificamente dois estudos nos quais o poder de
resolução dos microssatélites permitiu resolver questões de parentesco
que tiveram impacto direto nas estratégias de produção e seleção de
novas árvores superiores. Num primeiro estudo, um total de 32 possíveis
árvores mães foram testadas frente a quatro clones elite da
International Paper do Brasil com o objetivo de determinar a sua
maternidade e com isso buscar a geração de novos descendentes das árvores
mães identificadas.
A análise de maternidade foi realizada com 15 locos microssatélites para
cada clone descendente individualmente num procedimento seqüencial de
exclusão verificando o compartilhamento de pelo menos um dos alelos a
cada loco entre a suposta árvore mãe e o clone descendente testado. Um
elevado nível de compartilhamento alélico foi observado entre as 32 árvores
mães o que dificultou a análise de maternidade além do fato que o pai
também não era disponível e que portanto o poder de exclusão a priori
já era mais reduzido. Os dados genéticos indicaram um forte parentesco
entre as 32 árvores mães. Para dois dos quatro clones apenas uma suposta
mãe não foi excluída na análise de maternidade. Para o terceiro clone
duas árvores mães não foram excluídas, o que demandou análises de
locos adicionais. Para o quarto clone todas as árvores mães foram excluídas.
Estes resultados permitiram a utilização imediata das mães
identificadas como parentais em delineamentos de cruzamentos visando a
geração de novos clones elite no âmbito do programa de melhoramento.
Num segundo estudo, uma bateria de doze microssatélites foi utilizada
para determinar a composição paterna, nível de contribuição de
polinizadores externos e taxa de autofecundação de descendentes oriundos
de um pomar experimental de sementes da Aracruz Celulose. Famílias de
meios-irmãos de cada uma dos três genitores elite componentes do pomar
foram amostradas. Na análise de 30 descendentes de cada família, a
maternidade foi confirmada para 94%, indicando a ocorrência de pequena
proporção de mistura de sementes. Apenas um descendente foi detectado
como derivado de autofecundação. Observou-se uma alta taxa de contribuição
de polinizadores externos ao pomar na geração da amostra de descendentes
analisados, estimada em 62% O genitor denominado PAI2 apresentou o maior
sucesso reprodutivo entre os três genitores com uma taxa de paternidade média
de 50% dos descendentes do pomar. Os outros dois genitores denominados MÃE
e PAI1 apresentaram um desempenho muito incipiente na geração de
descendentes na amostra estudada com apenas 3 a 4% dos indivíduos. Além
do fato do pomar ser jovem e as copas serem ainda pequenas, a taxa de
contaminação por pólen externo ao pomar verificada neste estudo pode
ser explicada pelo fato deste pomar ser composto por apenas dois
potenciais polinizadores o que limita a possibilidade de fecundação caso
não haja coincidência de florada. A participação de pólen externo de
árvores mais velhas fora do pomar tende a ser potencializada nesta situação
uma vez que abelhas são atraídas para copas maiores com floradas mais
intensas e potencialmente mais sincronizadas.
Estes resultados forneceram informações importantes em relação a
futura colheita de sementes do pomar estudado, quais estratégias adotar
para a implantação de novos pomares, e quais as medidas necessárias
para reduzir a entrada de pólen externo ao pomar.
7. Variação genética e
endocruzamento em populações brasileiras de quatro raças caninas com
base na análise de marcadores microssatélites
Topo
Trabalho apresentado pela equipe da GENOMAX no 48º Congresso da Sociedade
Brasileira de Genética em Águas de Lindóia em 2002
Para
visualização de um arquivo pdf do pôster apresentado clique aqui
Resumo
Diversas raças caninas no mundo tem apresentando um crescimento
expressivo no número de animais registrados. Este crescimento demográfico
tem sido acompanhado por um aumento na ocorrência de várias patologias
que antes apresentavam casuística mais modesta. Vários fatores podem
estar contribuindo para este aumento na ocorrência de patologias, mas
certamente o componente genético relacionado ao incremento da endogamia
é o mais determinante, agravado pelo problema da desorganização do
sistema de registro genético e fraudes na declaração de parentesco.
O foco central deste projeto foi a investigação dos padrões de variação
genética e endogamia nas populações de algumas das principais raças
caninas no Distrito Federal. Foram coletadas amostras de sangue de 375
animais ao acaso, evitando parentes de primeiro grau, pertencentes a
quatro raças caninas que vem apresentando crescimento significativo no número
de registros e uma incidência crescente de problemas genéticos. As
amostras de DNA dos animais foram analisadas com dez locos microssatélites
recomendados pela ISAG (International Society of Animal Genetics) para
tipagem canina em um sistema multiplex. Bancos de dados de freqüências
alélicas para cada raça foram gerados.
Embora alguns alelos raça-específicos tenham sido observados, as diferenças
significativas entre raças foram quanto às distribuições relativas das
frequências alélicas. Os coeficientes de endocruzamento (f) multiloco
foram significativamente maiores que zero (IC a 95% por "bootstrap")
para Cocker Spaniel (f=0,06), Poodle (f=0,095) e Pastor Alemão (f=0,089),
mas não para Rottweiler (f=-0,017). Para a população de Rottweiler a
diversidade alélica e heterozigosidades foram significativamente menores
do que para as demais raças. Embora um menor número de animais tenha
sido utilizado para Rottweiler, este resultado sugere uma base genética
mais estreita para esta raça mas não um efeito fundador uma vez que f não
foi significativamente diferente de zero.
Este resultado pode ser explicado pelo fato do interesse nesta raça ser
mais recente coincidindo com uma intensa importação de animais de
diversos países na formação dos planteis nacionais. Uma diferenciação
genética significativa entre as raças foi verificada (Fst=0,145 entre as
quatro raças) sendo que Cocker e Poodle são as raças geneticamente mais
próximas (Fst=0,06 Dist. Nei =0,199) enquanto Rottweiler é a raça
geneticamente mais distinta (Fst=0,28 em relação a Pastor Alemão). Este
padrão de forte diferenciação indica um passado de isolamento genético,
e intensa seleção artificial.
O sistema multiplex de 10 locos mostrou-se altamente informativo para a
resolução de investigação de vínculo genético bem como para o
estabelecimento de um sistema de gerenciamento e controle dos níveis de
endocruzamento em programas de reprodução por “linebreeding” e
introdução de novos animais em programas de “linecrossing”. Topo
|
|
DNA
ANIMAL
Acesso Rápido |
